تبلیغات
آزمایشات و عملکردها - روش رنگ آمیزی اسپور (هاگ ) باکتری

آندوسپورهای (هاگهای) باکتریایی ، ساختارهای کروی و یا بیضی شکل کوچکی هستند که نسبت به دمای بالا ، تشعشع و وجود مواد شیمیایی از قبیل ضد عفونی کننده ها بسیار مقاوم هستند . هاگها به شکل درون سلولی توسط برخی از باسیلها تولید می شوند به همین دلیل به آنها آندوسپور می گویند. آندوسپورها از سلولهای مولد کوچکترند و مشخصات متقاوتی دارند که قابل توجه تر از همه مقاومت زیاد آنها نسبت به شرایط نامساعد است .

هاگ بخشی ازچرخه زندگی بعضی از جنسها باکتریها می باشد و در واقع هاگ یک مرحله خفته یا غیر فعال از زندگی باکتری است . هاگزایی در باکتریها بر خلاف آنچه در بعضی گیاهان عالی دیده می شود ، نوعی تکثیر تولید مثلی نیست. زیرا هر باکتری فقط یک هاگ تولید می کند و هر هاگ به نوبه خود به یک سلول رویشی (باکتری فعال) تبدیل می شود. بنابراین در گونه های مولد هاگ مانند سایر گونه های باکتریایی تکثیر از طریق تقسیم دوتایی باکتری انجام می شود.

وجود هاگ در کشت باکتریها برای تشخیص و تفکیک آنها اهمیت دارد ، زیرا تشکیل هاگ اساسا محدود با باکتریهای گرم مثبت میله ای شکل در دو جنس باسیلوسها و کلستریدیومها است .

اندازه و محل قرار گرفتن هاگ در داخل باکتری نیز برای تشخیص ارگانیسمها اهمیت دارد مثلا هاگها می توانند در مرکز ، نزدیک به انتها و یا در انتهای یاخته قرار بگیرد. قطر هاگ می تواند بزرگتر و یا کوچکتر از خود باکتری باشد . اگرهاگ قطر بیشتری نسبت به یاخته رویشی داشته باشد موجب تورم یا بزرگی و تغییر شکل باکتری می شود.

تعدادی از باسیلهای هاگزا از عوامل مولد بیماری هستند . کلستریدیومهای بی هوازی از مشهورترین آنها هستند. کلستریدیوم بوتولینوم موجب مسمومیت غذایی (بوتولیسم) کشنده می شود. کلستریدیوم پرفرنجنز مولد قانقاریای گازی (شاربن علامتی) و کستریدیوم تتانی مولد کزاز(تتانوس) است . تمام این کلستریدیومهای اسپورزا اگزوتوکسینهای (سم خارجی)قوی تولید می کنند که اغلب کشنده هستند. قویترین اگزوتوکسین توسط کلستریدیوم بوتولینوم تولید می شود. مصرف مقدار بسیار کم از ماده غدایی دارای سم بوتولیسم معمولا موجب مرگ می شود. یک شیشه کوچک نوشابه حاوی سم بوتولیسم برای کشتن تمام مردم کره زمین کافی است .

هاگهای کلستریدیوم پرفرنجنز و کلستریدیوم تتانی در خاک و بنابراین در مواد کثیف و غذا وجود دارند. در هر دو بیماری هاگها توسط خاک و یا مواد خاک آلود داخل زخم می شوند. اگزوتوکسین قانقاریای گازی و کزاز در مقایسه با بوتولیسم کندتر عمل می کند بنابراین از طریق تلقیح آنتی توکسین می توان آنها را خنثی کرد. به دنبال خنثی سازی برای کشتن باکتریهای مولد توکسین از آنتی بیوتیک استفاده می شود و بافتهای آسیب دیده را قطع می کنند تا شریاط بی هوازی از بین برود. در واقع معالجه بموقع موجب نجات از مسمومیت ناشی از این دو باکتری می شود.

طریقه کشت باکتریهای بی هوازی در آزمایشگاه به این ترتیب است که بعد از انتخاب محیط کشت مناسب جهت کشت باکتری مورد نظر پلیت را در وسیله ای بنام جار بیهوازی قرار می دهند تا این وسیله شرایط یک محیط بیهوازی را برای باکتری ایجاد نماید .

عملکرد جار بیهوازی به این صورت است که بعد از قرار دادن پلیتها در داخل آن از گاز پک استفاده می شود.  که بعد از بسته شدن کامل درب جار سطح گاز پک را با آب آغشته کرده و آنرا داخل جار قرار دهید . عملکرد گاز پک به این صورت است که مواد داخل گاز پک در طی واکنش با آب اکسیژن محیط داخل جار را مصرف کرده و با حذف اکسیژن محیط شرایط بیهوازی برای رشد باکتری فراهم می شود. برای نشان دادن صحت کار از نوارهای اندیکاتور استفاده می شود . این نوارهای باریک حاوی موادی استکه در حالت عادی برنگ آنی می باشد و هنگامی که اکسیژن از محیط حذف می شود این مواد هم تغییر رنگ داده و بحالت بی رنگ در می آید . پس برای نمایان شدن شرایط بیهوازی محیط یک عدد از این نوارها را هم داخل جار می اندازید. بعد از سپری شدن مدت لازم برای رشد باکتری شما می توانید رشد کلنی ها را در پلیتها مشاهده کنید.

به دوطریق می توان هاگها را زیر میکروسکوپ مشاهده نمود :

1-     چون هاگ پوشش مقاومی است که در برابر نفوذ رنگ مقاومت می کند بنابراین در رنگ آمیزی معمولی می توان هاگها را به صورت ناحیه رنگ نشده در داخل سلول رویشی (باکتری مولد) مشاهده نمود.

2-     اگر تعداد هاگهای موجود کم باشد و یا اگر از داخل باکتری مولد خارج شده و در گستره به صورت پراکنده باشند اغلب توسط رنگ آمیزی ساده و یا گرم قابل مشاهده نخواهند بود.

رنگ آمیزی شفر- بولتون یک رنگ آمیزی افتراقی است که برای مشاهده آندوسپور و سلول رویشی (مولد) ابداع شده است. با استفاده از این روش خود هاگ رنگ می گیرد و هاگهای آزاد به آسانی قابل روئیت خواهند بود. در این روش برای نفوذ رنگ اولیه (مالاشیت گرین) به داخل پوشش هاگ از حرارت استفاده می شود . همان خصوصیاتی که رنگ آمیزی هاگ را مشکل می کند ، رنگ را پس از نفوذ آن به داخل هاگ بخوبی حفظ می کند.مالاشیت گرین به آسانی از باکتریهای مولد شسته می شود زیرا دیواره سلولی باکتریهای بدون هاگ بر اثر حرارت آسیب دیده و پاره شده است بنابراین سلول رویشی رنگ دوم ، یعنی سافرانین را جذب می کند.

در مشاهده میکروسکوپی لام رنگ آمیزی شده ، هاگها درون سلول رویشی سرخ رنگ ، بصورت بخشهای بیضوی یا کروی کوچک سبز رنگ مشاهده می شوند.

رنگ آمیزی هاگ به روش شفر- بولتون :

از یک باکتری مولد هاگ مانند باسیلوس سوبتیلیس گستره ای تهیه کرده  و طبق معمول آنرا با حرارات تثبیت کنید.

1-     لام را به رنگ مالاشیت گرین آغشته کنید.

2-     لام آغشته به رنگ را حرارت دهید تا رنگ بخار شود . این عمل را با وارونه کردن شعله گاز بر روی لاک و عبور شعله به تناوب از روی رنگ انجام دهید.وقتی که رنگ شروع به بخار شدن کرد شعله را کنار ببرید همینکگه تبخیر متوقف شد دوبار کار را تکرار کنید و نگذارید رنگ بجوشد . مدت 3 تا 5 دقیقه به ترتیب ذکر شده عمل کنید و اگر مالاشیت گرین کاملا از روی لام تبخیر شد دوباره مقداری رنگ به لام اضافه کنید.

3-     بگذارید لام سرد شود تا از شکستن آن جلوگیری شود . به موازات سرد شدن لام به اضافه کردن رنگ ادامه دهید زیرا رنگ هنوز در حال تبخیر است .

4-     رنگ اضافی را از روی لام خالی کنید و بمدت 30 ثانیه لام را با آب بشوئید.

5-     لام را روی تشتک رنگ آمیزی قرار داده و آنرا با رنگ دوم (سافرانین) آغشته کنید و بگذارید یک دقیقه بماند .

6-     رنگ اضافه را خالی کرده و لام را بشوئید.

7-     لام را به دقت خشک کنید و بگذارید در هوا خشک شود.

لام رنگ آمیزی شده را توسط عدسی 100 همراه با روغن سدر مشاهده کنید. اسپورها گرد و یا بیضی برنگ سبز و سلولهای رویشی ، قرمز دیده می شوند.

طرز تهیه رنگها و محلولها:

-         مالاشیت گرین (محلول 5/.%)

5 گرم مالاشیت گرین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.

-         سافرانین (محلول 5/.%)

5/.گرم سافرانین را در 100سی سی آب مقطر حل کنید.